Ein Mann wird sich seinem Schicksal stellen, ein Held wird sich offenbaren.

Als ein fehlgeschlagenes Kernfusionsexperiment zu einer Explosion führt, die seine Frau tötet, verwandelt sich Dr. Otto Octavius (Alfred Molina) in Dr. Octopus, einen Cyborg mit tödlichen Metalltentakeln. Doc Ock macht Spider-Man (Tobey Maguire) für den Unfall verantwortlich und sinnt auf Rache. Währenddessen kämpft Spideys Alter Ego, Peter Parker, mit schwindenden Kräften und Selbstzweifeln. Erschwerend kommen der Hass seines besten Freundes (James Franco) auf Spider-Man und die plötzliche Verlobung seiner wahren Liebe (Kirsten Dunst) mit einem anderen Mann hinzu.